На заседании Президиума РАМН заслушан научный доклад директора института, руководителя лаборатории генной инженерии патогенных микроорганизмов, члена-корреспондента РАМН А.Л.Гинцбурга "Новые направления в медицинской микробиологии".
В докладе отмечено, что в настоящее время исследования социального поведения бактерий являются одним из наиболее актуальных направлений медицинской микробиологии.
Феномен социального поведения бактерий, или "чувство кворума" (Quorum sensing, QS), был впервые описан при изучении биолюминесценции у морской бактерии Vibrio fisheri. Было доказано, что свечение бактерий, обусловленное продуктами генов биолюминесценции, осуществляется при достижении определенной плотности популяции и контролируется сигнальными молекулами, продуцируемыми самими бактериями и работающими по принципу аутоиндукторов (АИ). После того, как молекулы АИ были выделены, удалось исследовать их структуру. Первый известный АИ оказался 3-охо-С6-HSL лактоном, свободно диффундирующим из бактериальных клеток в окружающую среду и обратно. Далее было установлено, что зависимая от плотности клеточной популяции аутоиндукция специфических бактериальных генов осуществляется с помощью регуляторных белков LuxI, представляющего собой ацил-HSL синтазу, участвующую в биосинтезе сигнальных молекул АИ, и LuxR, являющегося активатором, способным связываться с молекулами АИ и в таком виде активировать транскрипцию оперонов и генов, контролируемых QS системой.
Теперь известно, что по типу QS, помимо биолюминесценции, регулируется широкий спектр физиологических процессов, включая синтез детерминант вирулентности у патогенных бактерий, перенос конъюгативных плазмид, синтез антибиотиков, образование биопленок и даже процесс репликации у Е.сoli. У грамположительных бактерий в качестве молекул, регулирующих социальное поведение, чаще всего выступают пептиды или модифицированные пептиды.
У нескольких патогенных бактерий, использующих системы LuxI/LuxR во время колонизации растений или животных, установлена связь между явлением QS и вирулентностью. Показано участие регуляторных систем QS в контроле экспрессии генов вирулентности у холерного вибриона, у бактерий Burkholderia, у энтеропатогенных и энтерогеморрагических E.coli, у сальмонелл. Наиболее хорошо системы QS изучены у Pseudomonas aeruginosa и Staphilococcus aureus.
P.aeruginosa обладает, по меньшей мере, двумя системами, работающими по принципу QS: LasI/LasR и Rh1I/Rh1R. В результате инсерционного мутагенеза у P.aeruginosa идентифицировано более 40 генов, регулируемых на основе QS. Экспрессия этих генов увеличивается в 5 и более раз в присутствии аутоиндуктора.
Система QS P.aeruginosa функционирует следующим образом: при достижении высокой плотности клеток белок LasR связывается со своим индуктором и образовавшийся комплекс активирует транскрипцию генов, кодирующих синтез факторов патогенности, ответственных за повреждение тканей организма хозяина. Далее система включает работу нового набора генов, кодирующих белки, ответственные за синтез вторичных метаболитов, антибиотика тиоцианина, пилей IV типа, а также инициирующих образование биопленок.
По-видимому, таким образом обеспечивается последовательная инициация каскадов двух регуляторных систем и определенный порядок проявления активности контролируемых этими системами генов. Этот генетический механизм позволяет патогенным бактериям очень рационально реализовать свой болезнетворный потенциал. Бактерии атакуют эукариотическую клетку хозяина, синтезируя факторы патогенности, только после достижения ими определенной плотности, при которой синтезирующееся количество факторов патогенности гарантирует успешное развитие инфекционного процесса. Данный момент определяется системой QS.
Социальным поведением патогенных бактерий объясняется такое важное для разных областей медицины явление, как образование биопленок. Оно является одной из основных стратегий выживания 99,9% бактерий в окружающей среде, поскольку в составе биопленки они защищены от антибактериальных препаратов, включая антибиотики, бактериофаги или фагоциты. Поэтому, нет ничего удивительного в том, что антибиотикотерапия и механизмы естественной защиты макроорганизма (антитела и фагоциты) бессильны перед такими инфекциями.
Биопленки оказались высокоорганизованными бактериальными сообществами, в которых бактерии могут жить прикрепленными к поверхности. Они снабжены каналами для водоснабжения, для распределения питательных веществ между членами сообщества и удаления отходов жизнедеятельности клеток. Сравнение профилей экспрессии генов в клетках одних и тех же бактерий, существующих в составе биопленки или в планктонном свободном состоянии, показало, что разницу составляют около 45 дифференциально экспрессирующихся генов. Более того, было показано, что дифференциальная экспрессия генов наблюдается в разных местах биопленки. Это может свидетельствовать о выполнении индивидуальными членами бактериального сообщества разных функций, что способствует повышению выживаемости всего сообщества.
Структура биопленки и особенности физиологии составляющих ее клеток обеспечивают многократно повышенную по сравнению с аналогичными свободно живущими бактериями устойчивость членов сообщества к антимикробным препаратам, будь то антибиотики или факторы иммунной защиты макроорганизма.
Предполагаемые механизмы такой устойчивости следующие:
затрудненное и замедленное проникновение антимикробных агентов через полисахаридный матрикс биопленки;
замедленная скорость роста бактерий в биопленке;
другие физиологические изменения, обусловленные скоростью роста биопленки.
Изучение социального поведения бактерий в НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи ведется по следующим направлениям.
Впервые на примере внутриклеточного патогена L.monocytogenes показано, что QS может негативно регулировать экспрессию генов факторов патогенности. Предполагается, что такая модификация действия QS является всеобщей у внутриклеточных патогенов и позволяет им целенаправленно, подавляя экспрессию факторов патогенности, способных разрушать мембрану клетки-хозяина, накапливаться в большой концентрации перед тем, как перейти к стадии возможной диссеминации. В этой системе идентифицирована сигнальная молекула, аутоиндуктор (ауторепрессор), которая является циклическим дипептидом фенилаланина и пролина. Данное соединение количественно взаимодействует с активированным углем, приводя к дерепрессии генов факторов патогенности, в частности, лецитиназы. На этом переходе основан простой микробиологический метод дифференциальной диагностики патогенных листерий от непатогенных.
Показано, что аутоиндуктор широкой специфичности (А2 класса) позволяет переводить некультивируемые формы ряда патогенных бактерий в культивируемое состояние. Начаты работы по исследованию возможной роли аутоиндукторов А2 класса в дифференциальной экспрессии генов у бактерий, находящихся в составе биопленок.
Использование библиотек химических соединений как универсального подхода для поиска ингибиторов социального поведения бактерий в тех случаях, когда неизвестна природа аутоиндуктора. Для этого создается генетическая конструкция, содержащая промотор гена, кодирующего секретируемый фактор патогенности и бета-галактозидазу, и отбирается соединение, подавляющее появление бета-галактозидазной активности при достижении определенной плотности бактериальной популяции.
Заслушав и обсудив доклад члена-корреспондента РАМН А.Л.Гинцбурга "Новые направления в медицинской микробиологии", Президиум РАМН отметил, в частности, что в настоящее время изучение коллективного поведения патогенных бактерий является одним из наиболее приоритетных направлений медико-биологических исследований. Коллективное поведение бактерий определяет как вирулентные свойства патогенов, так и возможность эффективного генетического обмена между бактериями при их существовании вне организма-хозяина, что является основой для возникновения новых форм и видов возбудителей инфекционных заболеваний.
Рассматриваемая проблема относится к приоритетным направлениям фундаментальных исследований РАМН и обладает высокой научной и практической значимостью.
Президиум РАМН считает, что исследование процессов образования, строения и функционирования биопленок, изучение их роли в устойчивости патогенных бактерий к антибиотикам, к дезинфекционным препаратам, к факторам иммунной защиты, в формировании тяжелых хронических заболеваний человека, в длительном сохранении патогенов в объектах внешней среды - являются одной из важнейших задач современного этапа развития медико-биологических исследований.
Своим решением от 25 июня 2003 г. (протокол № 10) Президиум РАМН постановил:
1. Отметить исключительную важность исследований по проблеме коллективного поведения бактерий и считать целесообразным в дальнейшем сконцентрировать их на решении вопросов
• расшифровки молекулярно-генетических механизмов коллективного поведения бактерий, лежащих в основе образования бактериальных сообществ и играющих важную роль в инфекционной патологии как на уровне образования биопленок, так и в регуляции секретируемых факторов патогенности;
• разработки универсальных подходов для создания химических соединений, являющихся ингибиторами коллективного поведения бактерий;
• создания лабораторных моделей, позволяющих изучать роль бактериальных биопленок в инфекционной патологии, в биотехнологии, в других областях медицины;
• изучения факторов, создающих возможность эффективного генетического обмена между бактериями в составе биопленок;
• исследования роли биопленок в формировании стойких источников внутрибольничных инфекций.
2. Директорам НИИ в рамках приоритетных направлений НИР в области профилактической медицины на 2001-2005 гг. расширить проведение фундаментальных и прикладных исследований по актуальным направлениям изучения коллективного поведения бактерий.
3. Рекомендовать профильным Научным советам включить в научную тематику исследования, направленные на изучение роли биопленок в инфекционной патологии человека.