Результаты работ, проведенных при выполнении государственного контракта №14.740.11.0177 «Роль нейротрофических факторов в патогенезе нейродегенеративных заболеваний и возможность их применения в терапии паркинсонизма и бокового амиотрофического склероза» от 15 сентября 2010 г. федеральным государственным бюджетным учреждением «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации в рамках мероприятия 1.1 ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013 годы».
На основании экспериментальных данных показано, что гибель нейронов, вызванная мутациями известных генов, может быть остановлена путём введения в геном клетки-мишени терапевтического гена с целью повышения жизненной стойкости нейрона или путём замены погибших нейронов на молодые здоровые нервные клетки путём трансплантации стволовых клеток.
Одним из перспективных методов доставки генетического материала в органы и клетки-мишени являются вирусные векторы. Трансплантация генетически модифицированных стволовых клеток пуповинной крови генетическими конструкциями, полученными в ходе выполнения проекта, может быть введена в клиническую практику лечения больных, страдающих нейродегенеративными заболеваниями, после нейротравмы и ишемических инсультов.
Цель проекта – изучить влияние нейротрофических факторов VEGF, IGF-1, ангиогенина, GNDF и FGF2 на течение нейродегенеративных процессов, а также разработать эффективные методы доставки генов этих факторов в нервные клетки для проведения терапии паркинсонизма и бокового амиотрофического склероза (БАС).
Основные результаты проекта.
В ходе выполнения проекта получены новые оригинальные данные о влиянии нейротрофических факторов VEGF, IGF-1, ангиогенина, GNDF и FGF2 на течение нейродегенеративных процессов.
Разработаны эффективные методы доставки генов этих факторов в нервные клетки для проведения терапии паркинсонизма и БАС с использованием вирусных векторов (аденовирусных, лентивирусных), а также с помощью современных генно-клеточных технологий.
Разрабатываемые рекомбинантные вирусные векторы позволяют эффективно (более 50% трансдуцированных in vitro клеток) осуществлять доставку генов в клетки человека и животных.
Отработана эффективная технология препаративного наращивания и очистки полученных аденовирусных конструкций в биореакторах нового поколения (волновых биореакторах) для последующего проведения исследований.
Рекомбинантные аденовирусные векторы сконструированы по оригинальной технологии с использованием гомологичной рекомбинации в клетках E.сoli.
В работе использованы трансгенные мыши линии B6SJL-g(SOD1*G93A)dl1Gur/J, экспрессирующие мутантный человеческий ген Cu/Zn-супероксиддисмутазы SOD1 (G93A – глицин замещён на аланин в позиции 93) – удобная и на сегодняшний день наиболее адекватная экспериментальная модель БАС человека, которая широко используется для изучения механизмов развития данного заболевания в эксперименте.
В работе использована токсическая модель на крысах на фоне введения нейротоксина 6-гидроксидофамина, являющаяся наиболее адекватной моделью первичного паркинсонизма (болезни Паркинсона).
В России подобных комплексных исследований по изучинию влияния нейротрофических факторов VEGF, IGF-1, ангиогенина, GNDF и FGF2 на течение нейродегенеративных процессов, а также по разработке эффективных методов доставки генов этих факторов в нервные клетки для проведения терапии паркинсонизма и БАС не проводилось.
Выполненная работа по методическим подходам полностью соответствует мировому уровню исследований в области экспериментального моделирования генотерапевтических подходов к лечению нейродегенеративных заболеваний.
Область применения полученных результатов – разработка генно-инженерных и генно-клеточных подходов к терапии нейродегенеративных заболеваний.
Направления практического внедрения полученных результатов – проведение терапии паркинсонизма и БАС с использованием вирусных векторов (аденовирусных, лентивирусных), а также с помощью современных генно-клеточных технологий.
Экспериментальные и методические подходы, используемые в работе, открывают перспективу для разработки биологически безопасных генно-клеточных препаратов для использования в регенеративной медицине.
Разрабатываемые генно-инженерные и генно-клеточные подходы к терапии нейродегенеративных заболеваний могут быть использованы для создания инновационных отечественных лекарственных препаратов, не имеющих аналогов на рынке, и способствовать улучшению качества жизни и здоровья населения Российской Федерации.
Работы по проекту НИР проведены при участии соисполнителей: федерального государственного бюджетного учреждения «Научный центр неврологии» Российской академии медицинских наук и государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Казанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации.
Результаты НИР внедрены в образовательный процесс.
Лабораторные работы в объёме 30 часов «Разработка протокола получения генетически модифицированных мононуклеарных клеток пуповинной крови человека на базе аденоассоциированного вирусного вектора, экспрессирующего ростовые и трофические факторы» включены в программу курсов повышения квалификации «Разработка новых генно-клеточных конструкций для стимулирования регенерации в ЦНС на основе аденоассоциированного вируса, экспрессирующего нейропротекторные факторы (GDNF, VEGF, FGF2)» для работников банка стволовых клеток Казанского государственного медицинского университета.
Лекции в объёме 6 часов и практические занятия в объёме 12 часов «Молекулярно-генетические методы анализа экспрессии рекомбинантных генов» включены в программу курса «Генная и генно-клеточная терапия для регенеративной медицины» Научно-образовательного центра «Молекулярная и клеточная медицина» Казанского государственного медицинского университета.
Лекции в объёме 3 часа и практические занятия в объёме 6 часов «Стратегии генно-клеточной терапии бокового амиотрофиченского склероза с помощью генетически модифицированных мононуклеарных клеток пуповинной крови человека на базе аденоассоциированного вирусного вектора, экспрессирующего ростовые и трофические факторы» включены в программу элективного курса «Нейрогистология» на базе кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии Казанского государственного медицинского университета.
Лекция в объёме 2 часа «Боковой амиотрофический склероз. Этиология. Патогенез. Современные подходы к ведению больных» и практическое занятие в объёме 2 часа «Боковой амиотрофический склероз» внедрены в программу кафедры многопрофильной клинической подготовки факультета фундаментальной медицины Московского государственного университета им.М.В.Ломоносова.